Separační metody jsou v CTL velmi široce využívány. Používají se techniky plynové chromatografie (GC a GC/MS), kapalinové chromatografie (HPLC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC). V roce 2000 byla také zavedena metoda planární gelové elektroforézy (GE), která je využívána především v analýze bílkovin. Některé laboratoře byly dovybaveny systémem kapilární isotachoforézy.
CTL je vybavena plynovými chromatografy s automatickým dávkovačem, kapalinovými chromatografy s automatickým dávkovačem a zařízením pro TLC (vyvíječe, UV-box, rozprašovače). Dále je využívána řada detektorů (např. MS, FID, DAD, UV/VIS, RI, vodivostní) a dalších doplňků.
Popsané vybavení umožňuje analýzu směsí organických látek v nejobecnějším smyslu. Podle fyzikální povahy jsou látky analyzovány metodami plynové nebo kapalinové chromatografie. Ionizované látky (organické i anorganické), zejména ve vodných systémech, jsou analyzovány metodou kapilární isotachoforézy. Metoda TLC slouží především k rychlému „screeningu“ některých skupin látek (drogy, pesticidy, barviva, koření) nebo k orientační kvalitativní analýze.
Mezi nejvýznamnější komodity analyzované plynovou chromatografií patří líh a lihové nápoje, denaturanty lihu, uhlovodíková paliva a jejich směsi s estery mastných kyselin (tzv. směsná paliva), přírodní tuky, oleje, vosky a výrobky vzniklé jejich chemickým zpracováním, technické benziny a směsi rozpouštědel. Metodou GC/MS, která v sobě spojuje schopnost dělení složitých směsí s možností identifikace každé ze složek, jsou kromě obecné aplikace k identifikaci neznámých látek analyzovány směsi aromatických látek, pesticidy, dezinfekční prostředky, drogy, denaturanty lihu, organické výrobky kapitol 29, 30, 33 celního sazebníku.
Kapalinová chromatografie je základní metodou pro analýzu potravin, potravinových doplňků a různých chemických látek. Zejména to jsou mono- a disacharidy, škrob, konzervační látky, vitaminy, organické kyseliny, alkoholy, glykoly, alkaloidy, umělá sladidla a další pomocné potravinářské látky a denaturační činidla.
Základní význam mají takové metody, které přinášejí informaci o výrobcích zatížených spotřební daní - líh, denaturanty, uhlovodíková a směsná paliva. Některé další metody slouží k rozlišení výrobků s dvojí možností DPH, zvláště rozdílů mezi výrobky kapitol 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 29, 30, 33 a 38 celního sazebníku.